自主知识产权的实验教学仪器
——自由流电泳仪
1、自由流电泳仪简介
自由流电泳仪是由我校学生自主研发并拥有自主知识产权的电泳设备（已获得授权发明专利4项，见“2、授权发明专利”）。该设备不仅可以用于实验教学，也可以用于科学研究。它具有可连续分离、多种分离模式、无固体支持介质、处理样品量大和分离条件温和等优势。特别是在新兴的蛋白质组学研究中，自由流电泳能弥补目前蛋白质组学主流分离技术——双向凝胶电泳的不足之处，在分离难溶的膜蛋白和复杂蛋白质混合物以及低丰度蛋白质方面发挥其独特的优点，使大量活性生物材料纯品的获得成为可能。
该设备的突出优点体现在以下几个方面：1. 价格低廉。每台价格平均仅为20万元左右，而国外同类设备价格位于130-150万元之间；2.设备实现小型化、操作简便。国外设备体积庞大，操作复杂，系统稳定性差，实验准备时间长，平均需要半天的时间，而我们开发的设备实验准备时间仅需3-5分钟，系统稳定性优；3.高效、 直观，特别适合于小班教学，可广泛用于蛋白质、抗体、色素、病毒、微生物和各类细胞器等多种生物材料的分离。
目前《应用自由流电泳分离纯化细胞色素实验》已列为上海交通大学特色实验项目（见“3、上海交通大学特色实验项目”），并被编入《生物化学实验》教材（见“4、《生物化学实验》教材”）。该实验主要开设对象为我校生、农、医、药大平台本科生，每年受益学生达到200-300人（附课堂教学图片，“5、课堂教学图片”）。
2、授权发明专利
3、上海交通大学特色实验项目
4、《生物化学实验》教材及节选
五十四 自由流电泳分离纯化细胞色素C
目的要求
（1）通过细胞色素C的分离纯化，直观了解并掌握自由流电泳分离室中稳流的建立及分离纯化蛋白质的基本原理。
（2）了解并掌握自由流电泳仪的操作方法，分离纯化后的细胞色素C的纯度检测。
实验原理
自由流电泳(Free-Flow Electrophoresis, FFE)是一种连续性的兼具样品制备和分析功能的纯液相电泳技术。它具有实验条件温和、处理样品量大、分离效率高等优点。一个典型的自由流电泳装置是由两块相隔非常近的平行板组成，从而形成一个极薄的分离腔。样品和背景缓冲液被恒流泵从分离腔的进样口端连续引入分离腔，当样品进入分离薄腔以后，样品被背景缓冲液流带动流向出口端；同时在与液体流动方向垂直的方向上施加一电场，由于样品中各组分所带电荷数及分子质量不同，从而以不同速度横向移动，因此具有不同电泳迁移率的物质将在电场中迁移不同的距离，从而在分离腔出口端的不同出口处得到收集（图4.11）。
图4.11 自由流区带电泳分离原理示意图
细胞色素C的等电点为9.6，在Tris-HCl（pH 8.5）的背景缓冲液中，细胞色素C带正电荷，在电场作用下偏向负极，细胞色素C粗品中其余蛋白质要么带负电迁向正极，要么向负极偏移的角度小从而与细胞色素C分开。
试剂和器材
一、试剂
Tris（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）,盐酸（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司），商品化的甲基绿染料(含85%的甲基绿和12%的结晶紫，化学纯，上海国药集团化学试剂有限公司），细胞色素C粗品（上海华通生物技术有限公司提供），精制细胞色素C（上海华通生物技术有限公司提供）。
背景缓冲液为：10 mM pH 8.5的Tris-HCl溶液，样品溶液为：细胞色素C粗品溶解于背景缓冲液中，电极缓冲液为：40 mM pH 8.5的Tris-HCl溶液。
二、器材
小型自由流电泳仪（型号HT-ffe-IIAâ，上海华通生物技术有限公司），包括FFE分离室（FFE分离的关键设备）、多道恒流泵（用于输送背景电泳缓冲液）、恒流泵（用于输送电极缓冲液）、600 V电泳电源（用于形成分离电场）、收集设备等（图4.12）。
图4.12 小型自由流电泳仪结构示意图
漩涡混匀仪（QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，江苏，中国）；pH计（Metter-Toledo，320pH meter，Metter-Toledo仪器上海有限公司，上海，中国）；离心机（Anke TGL-16G，上海安亭科学仪器厂，上海，中国）；分析天平（AB104-N，梅特勒-托利多仪器上海有限公司，上海，中国）。
操作方法
1. 打开恒流泵，将电极室注满电极缓冲液。
2. 打开多道恒流泵，将超纯水泵入分离腔，当超纯水刚进入分离腔时，应将分离腔出口端微微抬起，调低流速，使超纯水缓慢并均匀进入分离腔，从而将气泡从分离腔排出。当气泡完全排出后，继续泵入超纯水冲洗1 min，再更换Tris-HCl缓冲液。
3. 选择从阳极端数第6根上样管进样，用多道恒流泵把缓冲液和样品泵到分离室中，通过限速阀控制样品的流量，同时根据分离室的大小，选择合适的背景缓冲液流速。
4. 开始进行甲基绿染料样品进样，观察分离室流形是否稳定，是否扭曲变形。如存在这些问题，检查气泡是否排除、分离室密封性是否完好，调整直到能够形成稳定的流形。用相机或手机拍照成像。
5. 在以上实验的基础上，将电极室中电极接通600 V电泳电源，调整电压至200 V，开始进行细胞色素C粗品的分离。如分离室稳定，我们能够直接观察到稳定的细胞色素C的流形。用相机或手机拍照成像。
6. 通过出口管中溶液的颜色，判断分离情况，根据分离纯化情况进一步优化背景缓冲液的流速、电压及上样管的位置以获得最佳的分离效果。简要优化实验条件后，开始收集细胞色素C分离的样品。
7．样品收集完后，应用超纯水冲洗分离腔5 min，从而排出背景缓冲液和剩余样品。
8. 收集16个出口管中的样品溶液，进行PAGE电泳，对分离纯化产物进行纯度鉴定。
9. 通过紫外分光光度计对纯化后的细胞色素C进行定量检测，同时计算样品的处理量、回收率。
注意事项
(1) 若发现背景缓冲液中产生大量气泡，应停止实验，重复步骤2，将气泡排出。
(2) 开始加电压后，严禁触碰电极或与电极接触的溶液。
(3) 做甲基绿染料实验时，应调节限速阀，使条带宽度控制在理想范围内，随后进行细胞色素C粗品分离实验时，限速阀保持不变。
(4) 收集样品时，需在电场作用下样品条带稳定后再开始收集，收集的样品量足够后续检测即可停止收集。
思考题
1.自由流电泳分离纯化蛋白质有哪些特点？
2.如何压缩FFE分离细胞色素C的分离区带，提高分离效率？
3.自由流电泳在生物样品的分离制备中有哪些应用？
5、课堂教学图片
6、高等学校国家级实验教学示范中心十年建设成果展示交流会
